Иммуноферментный анализ (ифа, elisa) — суть, принцип метода и этапы исследования. анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Напоминаем вам, что самостоятельная интерпретация результатов недопустима, и приводимая ниже информация носит исключительно справочный характер. Иммуноферментный анализ: показания к назначению, правила подготовки к сдаче анализа, расшифровка результатов.

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. Enzyme immunoassay, EIA) –лабораторный метод определения различных соединений (макромолекул, вирусов и пр.), в основе которого лежит реакция антиген-антитело.

Генетически чужеродные вещества, попадая в организм человека, вызывают специфические процессы, направленные на удаление этих веществ. Система организма, выполняющая данную функцию, называется иммунной системой, а сами процессы – иммунологическими.

Иммунная система представляет собой совокупность лимфоидных органов, которые функционируют согласованно за счет миграции лимфоцитов из крови в ткани и из ткани в кровь, медиаторов (посредников) и других факторов.

В- и Т-лимфоциты

Иммунная система слагается из центральных и периферических органов. К центральным относят тимус и костный мозг. В них лимфоциты дифференцируются (созревают) до стадии функционально активной клетки. К периферическим органам иммунной системы принадлежат лимфатические узлы, селезенка, лимфоидные структуры пищеварительного тракта, аппендикс, миндалины. В этих органах лимфоциты контактируют с антигеном, взаимодействуют между собой и с другими элементами иммунной системы. Практически все периферические органы иммунной системы являются фильтрами или барьерами для распознавания, захвата и расщепления антигена.

Антиген (англ. antigen от antibody-generator — «производитель антител») — любое вещество, несущее признаки генетически чужеродной информации, которое организм рассматривает как чужеродное или потенциально опасное и против которого начинает вырабатывать антитела (иммунный ответ).

Способность антигенов вызывать иммунный ответ называется иммуногенностью, а способность образовывать комплексы с антителами – антигенностью.

К антигенам относятся белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, в том числе и в составе компонентов различных биологических структур (клеток, тканей, вирусов и т.д.).

Антитела (англ. antibody) – это специальные белки иммуноглобулины (Ig), которые вырабатывает иммунная система в ответ на попадание любого чужеродного агента в организм для борьбы с ним.

Антитела обладают способностью образовывать прочные комплексы с антигенами для последующего удаления их из организма. Иммуноглобулины (Ig) по своей химической структуре относятся к гликопротеидам (белкам, содержащим в своей структуре олигосахариды). По своим свойствам и структурным особенностям иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Антиген, встречаясь в кровотоке с соответствующим ему рецептором В-лимфоцита, активирует его. В-лимфоцит многократно делится и образует клон плазматических клеток. Каждый клон клеток секретирует однородные по своей структуре антитела.

Показания к проведению иммунологического обследования:

Острые и хронические бактериальные, вирусные и паразитарные инфекции (болезнь Боткина, сепсис, пневмония, лейшманиоз, туберкулез, лепра и др.), подозрение на СПИД. Аутоиммунные заболевания (ревматическая болезнь, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и др.).

Аллергические заболевания (бронхиальная астма, поллиноз и др.). Злокачественные заболевания (лейкозы, лимфогрануломатоз и др.). Кожно-венерические заболевания (контактный дерматит, пузырчатка, микоз, сифилис и др.). Патология беременности. Контроль цитостатической, иммунодепрессивной и иммуностимулирующей терапии.

Обследование пациентов до и после трансплантации. Первичные иммунодефицитные состояния и др. Постановка иммунологического диагноза складывается из следующих этапов:

1. Сбор иммунологического анамнеза.
2. Выявление клинических проявлений иммунопатологии.
3. Иммунологические методы исследования.

В лабораторных исследованиях наибольшее распространение получил твердофазный иммуноферментный анализ.

В иммуноферментном анализе применяют ферменты, которые могут связывать антитела или антигены, меняют окраску специального хромогенного субстрата при взаимодействии с ним и могут быть зарегистрированы физико-химическим методом (методом спектрофотометрии, флуориметрическим, люминисцентным и др.).

На настоящий момент имеются усилительные системы, позволяющие регистрировать наличие всего нескольких сотен молекул ферментов в 1 мл раствора. Фермент – это сложное органическое вещество, вырабатываемое живой клеткой, способствующее различным химическим реакциям, происходящим в организме.

• Хромогенный субстрат – это вещество белковой природы, приобретающее определенную окраску после расщепления специфическим протеолитическим ферментом.
• Фотометрический анализ — метод качественного и количественного анализа, основанный на избирательном поглощении инфракрасного, видимого или ультрафиолетового излучения молекулами определяемого компонента или его соединения с соответствующим реагентом.
• По аналогичной схеме работают тест-системы для определения антител, но в качестве иммуносорбента в них используются антиген, а раствор, который добавляют, содержит раствор антигенов, меченых ферментом.

При проведении иммуноферментного анализа в качестве твердой фазы используется поверхность лунок полистиролового планшета, на которую адсорбированы входящие в состав тест-системы известные антитела (против определяемого антигена). В лунку вносят исследуемую сыворотку крови. При наличии искомого антигена он соединяется с антителом, и образуются комплексы. Лунки промывают и удаляют не связавшиеся компоненты. В лунки вносят антитела к искомому антигену, меченые ферментом. Меченые антитела присоединяются к предыдущему комплексу и также остаются на стенках. Затем в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат (перекись водорода) и хромоген (ортофенилендиамин). Если в исследуемой жидкости был антиген, фермент взаимодействует с перекисью водорода и разлагает его. Выделившийся при этом кислород окрашивает хромоген в желтый цвет. По интенсивности окрашивания, возникающего в результате реакции фермента и субстрата, можно судить о количестве антигенов. В клинической диагностике с помощью фиксированных на твердой фазе антител (антигенов), определяют присутствие антигенов микроорганизмов, антител к ДНК, иммунных комплексов, антигенов раковых клеток, антител к различным видам бактерий, вирусов, простейших.

Метод ИФА может применяться для диагностики:

• ВИЧ-инфекции;
• вирусных гепатитов;
• цитомегаловирусной инфекции;
• вируса Эпштейн-Барр;
• герпетической инфекции;
• коронавирусной болезни.

1. Для диагностики инфекций, передающихся половым путем:

• сифилиса;
• хламидиоза;
• трихомониаза;
• гонореи;
• уреаплазмоза.

1. Уровня гормонов в эндокринологии.
2. Аутоантител и маркеров онкологических заболеваний в онкологии.

3. Общего IgE и специфических IgE антител в аллергологии.
4. Лекарственных препаратов, наркотиков в биологических образцах.
5. Белков сыворотки крови (ферритина, фибронектина и др.).

Подготовка к процедуре

Взятие пробы для лабораторного исследования методом ИФА должно проводиться:

• желательно с 7 до 9 часов утра;
• натощак, т.е. через 8-12 часов после последнего приема пищи;
• после воздержания от алкоголя не менее 24 часов;
• до проведения диагностических и лечебных процедур;
• в ряде случаев следует учитывать фазу менструального цикла, фармакодинамику лекарственных препаратов, циркадные ритмы.

Пациент должен находиться в спокойном состоянии не менее 15 минут: сидя или лежа. Наложение жгута (манжеты) не должно превышать 1 мин.

Преимущества иммуноферментного анализа по сравнению с другими методами определения антигенов и антител:

• высокая чувствительность (ИФА может обнаруживать одиночные молекулы анализируемого вещества);
• возможность использования минимальных объемов исследуемого материала;
• стабильность всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА при хранении;
• простота проведения реакции;
• возможность автоматизации всех этапов реакции;
• относительно низкая стоимость диагностических наборов.

Иммуноферментный анализ может давать ложноположительный результат:

• при наличии ревматоидного фактора в крови, который является антителом против собственных IgG;
• при различных системных заболеваниях;
• при нарушениях обменных процессов в организме;
• при приеме некоторых лекарственных препаратов;
• у новорожденных детей.

Источники:

1. Л. К. Решетникова. Иммунология. – Благовещенск, 2019. — 176 с.
2. Гусякова О.А. Иммуноферментный анализ: учебное пособие для студентов лечебного, педиатрического, медико-профилактического факультетов, Самара: типография Клиник ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2010. — 32 с.

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Научная электронная библиотека Монографии, изданные в издательстве Российской Академии Естествознания

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ.

 enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр.

, в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом.

Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции.

Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Из-за разнообразия объектов исследования – от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

Одним из принципов классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с эти все методы можно разделить на две группы – гомогенные и гетерогенные.

Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным.

Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения [16].

В настоящее время EMIT (гомогенный ИФА) широко распространен во всем мире наряду с твердофазным ИФА (тИФА). EMIT по сравнению с тИФА является более экспрессным (до 2-х минут) и менее трудоемким, хотя менее чувствительный, и поэтому используется только в качественном анализе.

Возможна также классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества).

Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным.

Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.

Рис. 10. Конкурентный (а) и неконкурентный (б) ИФА

Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела.

После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.

Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.

«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Другим типом классификации схем ИФА является разделение по типу определения концентрации анализуемого вещества:

1) прямое определение образовавшихся иммунокомплексов (аналитический сигнал прямо пропорционален концентрации определяемого вещества) – прямой ИФА;

2) определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступившими в реакцию компексообразования антител – непрямой ИФА.

Так, среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

Прямой конкурентный формат ИФА использует в качестве меченного ферментом реагента одного из участников иммунохимической реакции (рис. 3) – определяемое соединение или специфический к нему диагностический реагент (антитела). В результате схема ИФА состоит из 3-х стадий:

• – сорбции (иммобилизации) специфических антител, либо конъюгата антигена,
• – аналитической стадии: конкурентной реакция Аг-Ат с участием меченого ферментом реагента (антигена или антител),
• – фермент-субстратной реакции, в результате которой образуется окрашенный (или люминисцентный) продукт.

Например, на полистирольный планшет иммобилизуют специфические антитела (рис. 11 в) иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела.

На второй стадии к иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. В этой схеме меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связывание с иммобилизованными специфическими антителами.

Рис. 11.

Виды конкурентного ИФА: а – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых антивидовых антител; б – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых специфических антител; в – прямой конкурентный ИФА с иммобилизацией специфических антител и использованием меченого антигена (аналита)

Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель (рис. 11 а, б).

Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА (рис. 11 а).

На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина аналитического сигнала в этом случае находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.

Применение универсального реагента – меченых антивидовых антител – даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам.

Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки.

Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.

ИФА наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях широко используется в ХТЛ, бюро судмедэкспертизы, клинико-диагностических лабораториях, медицинских центрах. Чаще всего применяется полуколичественный вариант методики, т.к.

в большинстве случаев необходимо дать заключение о том, превышает ли уровень метаболитов ПАВ в образце определенную пороговую концентрацию.

Однако метод ИФА может использоваться (и используется в некоторых случаях) для количественного определения метаболитов ПАВ с высокой чувствительностью – до 10–9 г/л.

Отдельно следует выделить иммунохимический метод выявления фактов употребления наркотиков в отдаленные промежутки времени (до 4 месяцев после последнего употребления ПАВ), основанный на определении антител к наркотическим веществам в крови человека [4, 5]. Данный метод использует прямую неконкурентную схему ИФА.

Компоненты, используемые в ИФА

1. Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата.

Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов катализируемой им реакции.

Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тирозина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции.

Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже.

Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

2. Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемилюминесцентных.

3. Антигены и антитела.

Аг и Aт, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. Кроме того, Аг должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант и гомогенностью.

Многие синтетические и рекомбинантные Аг вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА.

Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител.

Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности Ат распад комплекса Аг-Ат приводит к удалению связанного Аг из системы.

Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации Аг (Aт) в испытуемых образцах.

4. Получение конъюгата.

Конъюгат – это антиген или антитело, «сшитые» с ферментной меткой или белком-носителем. Получение коньюгата – один из важных этапов разработки ИФА.

При синтезе конъюгата с ферментом подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент – способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело – антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно.

Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы ИФА. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу.

Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с Аг или Aт и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и Аг или Aт осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

5. Твердая фаза.

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

1. Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:
2. – пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;
3. – ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорбция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсорбируемого вещества. В стандартных наборах ИФА используются 96-тилуночные прозрачные полистирольные планшеты.

Рис. 12.

Набор для ИФА-определения наркотических еществ в биологических жидкостях: – планшет с нанесенным антигеном; 2 – положительный и отрицательный контрольный образец; 3 – реагент для выявления образовавшихся иммунных комплексов; 4 – растворы буфера для приготовления анализируемых образцов; 5 – раствор буфера для проведения фермент-субстратного окрашивания;  – раствор для остановки реакции окрашивания субстрата;  – инструкция по применению

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала.

Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты – бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др.

Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Готовый набор для ИФА-определения наркотических веществ в биологических жидкостях выглядит следующим образом (рис. 12).

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) — один из видов иммунохимического анализа. Он основан на высокоспецифической иммунологической реакции антигена (АГ) с соответствующим антителом (АТ) с образованием иммунного комплекса. При этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции фермента с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. Стадия узнавания исследуемого соединения специфическим антителом;
2. Стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. Стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В реакции участвуют:

• Твердая фаза;
• АГ и АТ;
• Конъюгат (антиген или антитело, меченые ферментом);
• Ферментный маркер;
• Субстрат;
• Стоп-реагент (чаще всего применяют серную кислоту).

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Антигены и антитела

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант.

Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител.

Используемые АТ могут быть поли- или моноклональными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgG1, IgG2).

Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в образцах.

• Ферментные маркеры: наибольшее применение нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза.
• Субстраты
• Выбор субстрата, в первую очередь, определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция «фермент-субстрат» высокоспецифична.

• Для ПХ в качестве субстрата используют 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ хромоген). Происходит цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанного определяемого вещества;
• Для ЩФ субстратом является 4-нитрофенилфосфат;
• β-D-галактозидаза катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы.

Классификация ИФАВ основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1 — по типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА:

• В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры специфического связывания с ним;
• Для неконкурентных методов характерно присутствие на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2 — по принципу определения исследуемого вещества:

• Прямое определение концентрации вещества (АГ или АТ). Используют антитела к исследуемому веществу, соединенные со специфической меткой. В этом случае метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу;

• Непрямое определение концентрации вещества – по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

3 — по типу результатов:

• Количественный;
• Полуколичественный;
• Качественный.

Конкурентный ИФА

1. На твердой фазе иммобилизованы специфические моноклональные антитела;
2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях. Проводят инкубацию и отмывку;
3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем;
4. Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества обратно пропорциональна оптической плотности.

Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Неконкурентный «сэндвич» – вариант ИФАОсновным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА.

1. На твердой фазе иммобилизованы моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела;
2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают;
3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела —конъюгат. После инкубации проводят отмывку для удаления несвязавшихся антител;
4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем;
5. Проводят учет результатов на ИФА-ридере. Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна оптической плотности.

Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и диагностике инфекционных заболеваний. Результат исследования определяется при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической оптической плотности (ОПкрит., «Cut-off»).

Формулу для расчета «Cut-off» указывают в инструкции к тест-системе. В расчете «Cut-off» могут участвовать как усредненные значения оптических плотностей положительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального контрольного образца — контроля уровня среза. Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, образец считается положительным на специфические антитела.

Для полуколичественного варианта проведения методики рассчитывают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической плотностью Cut-off.

Образцы рассматриваются как:

• положительные, если отношение более 1,1;
• сомнительные, если отношение 0,9–1,1;
• отрицательные, если отношение менее 0,9.

Сомнительные результаты анализа нельзя однозначно интерпретировать и для уточнения результата необходимо повторить обследование через 1–2 недели.

Методом ИФА определяют:

• Гормоны;
• Онкомаркеры;
• Антитела (IgG, IgM) к возбудителям заболеваний — ToRCH-инфекций, туберкулеза, сифилиса, к вирусу гепатита С (ат ВГС), микоплазме, хламидиям, лямблиям, Helicobacter pylori и др.;
• Антигены вирусов —гепатит D, Е, А (ВГD, ВГЕ, ВГА), гепатит С (ВГСсore), гепатит В (НВs, НВе НВсore);
• Аутоиммунные заболевания.

Источники: 

Иммуноферментный анализ (ИФА) — что показывает, когда назначается ИФА крови

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод выявления в крови специфических антител, представляющих собой молекулы иммуноглобулинов.

Он отличается высокой точностью и чувствительностью, позволяет определить не только качественный, но и количественный состав антигенов и антител в организме.

В медицине иммуноферментный анализ применяется для выявления болезней, которые провоцируют микроорганизмы различных классов — от вирусов до паразитов, а также для диагностики аутоиммунных заболеваний.

Особенности анализа ИФА

Иммуноферментный анализ состоит из двух компонентов — иммунной и ферментативной реакции. Иммунная реакция связывает биологические молекулы, элементы клетки или микроорганизма, которые пытаются выявить. Ферментативная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции.

ИФА относится к непрямым методам диагностики, так как с ее помощью можно определить наличие антител к патогенному микроорганизму, а не самого возбудителя. Этот анализ рекомендуется выполнять совместно с ПЦР-диагностикой.

Важность иммуноферментного анализа несомненна: его применяют, если требуется определить стадию развития заболевания, провести мониторинг проведенного курса лечения, оценить ответ организма на лечение либо подобрать оптимальную схему терапии.

К преимуществам ИФА относят следующее:

• высокая чувствительность (до 90%), позволяющая обнаружить микроорганизмы даже в том случае, если они присутствуют в минимальных концентрациях;
• возможность выявить заболевание еще до проявления симптомов;
• скорость проведения анализа и получения результатов;
• возможность определить примерный срок заражения, а также тип течения инфекции (острая или хроническая);
• выявление с высокой степенью достоверности микроорганизмов, которые невозможно определить путем применения других диагностических методов (посева, микроскопии и т.д.).

Показания к проведению иммуноферментного анализа крови

Методика ИФА позволяет выявить в крови любой антиген — не только собственный, но и чужеродный для организма. Ее назначают при подозрении на скрытую инфекцию. Показаниями для проведения этого анализа являются:

• выявление различных инфекций (гепатиты, паразитарные инфекции, герпес, хламидии, токсоплазмоз, сальмонеллез, вирус Эпштейн-Барра);
• определение содержания гормонов для оценки работы органов эндокринной системы — щитовидной железы, гипофиза, половых желез;
• выявление и отслеживание онкомаркеров (ПСА у мужчин, фактор некроза опухоли и т.д.);
• диагностика аутоиммунных заболеваний (системный васкулит, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена).

Также иммуноферментный анализ позволяет определить наличие антител к вирусу у пациента после прививки.

ИФА не оказывает непосредственного воздействия на антиген: этот метод позволяет оценить реакцию организма на присутствие такого антигена.

Чаще всего для проведения иммуноферментного исследования используют сыворотку венозной крови, взятой у пациента натощак. Также для анализа могут использоваться околоплодные воды, спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела и слизь цервикального канала и уретры.

Подготовка к анализу ИФА

Чтобы снизить риск ошибки при проведении иммуноферментного анализа, пациенту рекомендуют подготовиться к этой процедуре. Речь идет о том, чтобы в течение 7-10 дней до назначенного исследования:

• прекратить прием антибиотиков, а также противовирусных и антигистаминных препаратов;
• исключить из рациона продукты-аллергены (шоколад, мед, орехи, яйца);
• отказаться от жирных, острых, жареных блюд, алкоголя, сладостей;
• ограничить физические нагрузки;
• избегать сильных эмоциональных потрясений.

За сутки до забора крови нужно прекратить курение.

Интерпретация результатов анализа

При выполнении иммуноферментного анализа выявляют антитела разных типов – иммуноглобулины классов M, A, G (JgM, JgA, JgG). Они появляются в разные промежутки времени.

IgM указывает на то, что инфекция находится на острой стадии развития. Этот иммуноглобулин появляется в крови на 4-5 день после предполагаемого заражения. Если выявляют IgM, то пациент в данный момент является больным.

IgG характеризует хроническую форму инфекционного процесса, а также свидетельствует о наличии стойкого иммунитета к антигену. Выработка этого иммуноглобулина происходит на 20-28 день с момента заражения. IgG может сохраняться в крови долгое время – несколько месяцев и даже лет.

IgA – иммуноглобулины, выявление которых указывает на переход острой формы инфекционного процесса в хроническую. Они вырабатываются на 14-20 день с момента заражения и сохраняются в крови больного около двух месяцев.

Анализ ИФА может демонстрировать разные комбинации этих иммуноглобулинов. В зависимости от сочетания, они указывают на определенный этап в развитии заболевания:

• JgM (-), JgG (-), JgA (-). Иммунитет к инфекции отсутствует.
• JgM (-), JgG (+), JgA (-). У больного имеется иммунитет, приобретенный после введения вакцины или выполнения прививки.
• JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+). У пациента присутствует острая инфекция.
• JgM (+), JgG (+), JgA (+). У больного протекает период обострения хронической инфекции.
• JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-). У пациента имеется хроническая инфекция.
• JgM (-). Пациент был заражен, но сейчас выздоровел.

Если ИФА направлен на исследование гормонов щитовидной железы, то его допустимые границы находятся в таких пределах:

• Тиреоглобулин – до 70 МЕ/мл.
• Тироксин – 64-146 нмоль/л.
• Трийодтиронин – 1,8-2,8 нмоль/л.
• Свободный тироксин – 11-25 пмоль/л.
• Свободный трийодтиронин – 4,49-9,3 пмоль/л.

При диагностике аутоиммунных заболеваний у пациента могут выявляться такие антитела:

• Антинуклеарные (аутоантитела к антигенам ядра клеток). Они характерны для системных аутоиммунных заболеваний.
• Антитела к растворимым нуклеарным антигенам. Такие компоненты проявляются при различных системных аутоиммунных процессах.
• Антикардиолипиновые антитела IgG и IgM. Они характерны для антифосфолипидного синдрома.
• Антитела к двухспиральной ДНК, которые являются специфичными для системной красной волчанки.
• Ревматоидный фактор. Антитела такого типа выявляют при ревматоидном артрите, хотя они не специфичны конкретно для этого заболевания и могут обнаруживаться при других отклонениях, а также у абсолютно здоровых пациентов.

Сейчас ИФА-анализ широко используется для выявления антител к коронавирусной инфекции.