— Первый вопрос: а как вообще выглядит тест на коронавирус? Экспресс-тест на ВИЧ мы все видели: белая лопаточка с ручкой и пробирка с реагентом. Через 15 минут готов результат. Новый коронавирус тестируется по методу полимеразной цепной реакции (ПЦР). Насколько вообще его сложно производить?
— Выглядит тест на коронавирус как пробирки с прозрачными жидкостями в коробочке или пакетике, как-то так. Но чтобы провести саму реакцию и получить результат, нужно еще специальное оборудование.
Комплект для ОТ-ПЦР в реальном времени производства компании BGI Group
Производить тест умеренно сложно, это высокие технологии, но очень хорошо отлаженные за много лет.
Ограничения — как на любом производстве: реагенты и материалы, производственные мощности и должная культура производства — не надо объяснять, что будет, если чихнуть в пробирку, — плюс кадры.
Каких объемов реально достигнуть — зависит от того, какие мощности будут задействованы: если, например, какие-то линии, которые сейчас производят ПЦР-тесты для других инфекционных заболеваний, волевым решением перебросить на SARS-CoV-2, производство возрастет.
— Почему сейчас тестируют коронавирус именно по методу ПЦР, а не иммуноферментного анализа, например, как ВИЧ? С ИФА диагностика была бы быстрее, дешевле? Или это вообще не имеет значения?
За подробностями лучше обратиться к специалистам в области молекулярной диагностики. Но, на мой взгляд, ПЦР с обратной транскрипцией, а именно он используется в случае с COVID-19, — хороший метод.
Для ПЦР-тестов характерна высокая чувствительность. В их основе лежит амплификация нуклеиновой кислоты, то есть даже при малом количестве копий в образце можно получить хороший сигнал.
Кроме того, для разработки таких тестов нужен, по большому счету, только геном вируса или часть генома…
— По факту ПЦР-тесты для COVID-19 появились почти сразу после того, как китайцы опубликовали расшифровку генома вируса. То есть для того, чтобы начать их разработку, не нужно было никаких образцов, хватило журнальной публикации и специалистов, способных быстро разработать технологию.
— Да. В том и прелесть ПЦР-теста, что для него достаточно генома вируса. Зимой, как только первый геном был опубликован, специалисты во всех странах начали заказывать синтез генетического материала nCoV-19.
Зная нуклеотидную последовательность генома, в лаборатории можно получить участок этого генома и дальше экспериментировать уже с ним.
В частности, проверить чувствительность и специфичность теста, используя вместо клинических образцов растворы ДНК.
В январе у ученых большинства стран вообще и не было другого выхода, настоящие пациенты имелись только в Китае. К такому методу могут быть претензии. Например, если чувствительность теста проверяется по растворам кДНК, не учитываются потери при обратной транскрипции. Тут разные другие тонкости. Но в целом ученые сработали очень оперативно.
ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом.
Он основан на многократном копировании (амплификации) определенных участков вирусной ДНК в лабораторных условиях.
По факту, чтобы «засечь» вирус в организме, с помощью специального фермента, собирающего из нуклеотидов по образцу вирусной ДНК ее копию, ученые дублируют фрагменты генетического материала вируса, пока их число не станет настолько большим, что будет возможно зафиксировать его присутствие с помощью флуоресцентных меток.
Как это работает?
Сначала вирусную ДНК выделяют из материала, представленного в лабораторию, денатурируют: на этом этапе двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C, чтобы цепи ДНК разошлись.
Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК.
Схема: как ДНК-полимераза копирует каждую из цепочек ДНК по отдельности. РНК-праймер изображен белым прямоугольником в начале каждой из двух цепей
Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На следующем этапе в смесь из ДНК, полимеразы и праймеров добавляются нуклеотиды — то есть строительный материал для воспроизводства, после чего емкость с нею нагревается до 37°C, и процесс запускается.
На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется (см. видео ниже).
Общая схема полимераной цепной реакции. Цифрами обозначены ее этапы.
В случае с вирусами, содержащими не «двойную» ДНК молекулу, а «одинарную» РНК (а это коронавирусы, или, например, ВИЧ), ученым приходится сначала провести обратную транскрипцию РНК с помощью фермента обратной транскриптазы, а уже потом производить амплификацию по той схеме, что была указана выше.
Именно так, собственно, поступает и сам вирус, попадая в клетку, перед тем как встроить свою ДНК в человеческую и приступить к синтезу собственных белков, из которых состоит его «тело» (то есть не генетического материала, а самих вирусных частиц, при ПЦР же, наоборот, копируется генетический материал, а не новые частицы вируса).
Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х.
Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах (Thermal cycler).
- Наглядно, как работает метод ПЦР, можно посмотреть на приведенном ниже видео.
- — Что касается ИФА-тестов для коронавируса, их разработать так и не успели?
— Почему? Тесты на определение антител к антигенам SARS-CoV-2 в крови существуют. У теста на антитела свои преимущества. Но я бы сказала так: они с ПЦР-тестом дополняют друг друга. Тест на антитела лучше работает на поздних стадиях. Антитела в крови сохраняются и тогда, когда вирус исчезает из организма, то есть с помощью такого теста можно узнать, кто переболел COVID-19 в прошлом.
— Даже если у пациента не было выраженных симптомов и дело обошлось без госпитализации?
— Да.
— А что за организации, кто в нашей стране занимается этими тестами? Роспотребнадзор?
— Роспотребнадзор — это очень обширная структура. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» в нее входит, он и разработал тесты, которыми пользуются в лабораториях Роспотребнадзора.
То есть производит тесты «Вектор», а проводят тестирование региональные центры Роспотребнадзора.
Также на данный момент зарегистрирована тест-система от ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Минздрава России (ЦСП).
У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший.
О разработке своих тестов заявили и некоторые другие организации — Научно-исследовательский институт микробиологии Минобороны РФ совместно с компанией СИНТОЛ, НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздрава России (НИЦ им. Н. Ф.
Гамалеи), компания «ДНК-технология». Производство собственных тест-систем планирует запустить Центр молекулярной диагностики CMD (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора).
И это хорошо, когда есть разные тест-системы, их можно сравнить, проверить результаты одной с помощью другой.
На первом заседании координационного совета по борьбе с коронавирусом вице-премьер РФ Татьяна Голикова сказала, что правительство ждет от регионов предложений о том, на базе каких еще лабораторий можно будет проводить эти исследования. Частные компании тоже смогут делать тесты на коронавирус на платной основе. Возможно, в самом скором времени будет новая информация о том, как все это будет происходить.
— На 15 марта появилась информация, что в России было произведено почти 110 тысяч тестов на коронавирус. Это много для наших масштабов или мало?
— По поводу возможности произвести достаточное количество тестов — тут много вопросов: производственные мощности, которыми мы располагаем, количество реагентов, которые понадобятся, наконец, лаборатории с необходимой техникой и обученным персоналом, где эти тесты проводить. Мало нам будет пользы и от миллиона тестов, если не хватит рук, чтобы эти тесты запускать. Все эти вопросы надо исследовать.
Тест ПЦР на коронавирус американского производства, фото: US Centers for Disease Control and Prevention
— Российских тестов несколько. В чем их принципиальные отличия? Почему государство выбрало именно те, что сделали в «Векторе»?
— Пока в России зарегистрировано три теста — два от «Вектора» и один от ЦСП. У тест-системы ЦСП чувствительность указана выше, есть внутренний контроль — РНК, которую добавляют в образец.
Если эта РНК исчезнет в процессе, не даст сигнала, значит, что-то пошло не так. Это знак, что могла исчезнуть и вирусная РНК, а стало быть, отрицательный результат следует считать ложноотрицательным.
Про остальные тест-системы поговорим, когда они получат регистрационные удостоверения.
Почему государство выбрало именно «Вектор» для выполнения этого задания, мне неизвестно. Наверное, могли бы выбрать и, например, ЦНИИ эпидемиологии того же Роспотребнадзора.
«Вектор» знаменит тем, что в нем работают с опасными патогенами, а «уханьский коронавирус» на тот момент выглядел очень пугающе: и по смертности среди заболевших, и по инфекционности были прямо страшные оценки.
Может быть, в этом причина, может быть, в чем-то другом, это надо узнавать у тех, кто принимал решение.
— В Европе существует обмен материалом между странами, а как у нас с его доступностью? И образцы генетического материала — они вообще нужны? Они доступны русским ученым, разработчикам?
— Про образцы генетического материала я уже объяснила. Но с доступностью культуры вируса у нас, по-видимому, не все просто. «Вектору» удалось его приобрести, где именно — не могу сказать, но были заявления, что у них вирус есть.
Впрочем, в США сейчас существуют компании, у которых разработчики тест-систем могут купить живой либо инактивированный SARS-CoV-2.
Еще в феврале группа исследователей коронавирусов из Университета Северной Каролины под руководством Ральфа Барика собиралась сделать целый синтетический SARS-CoV-2 на основе геномной последовательности, то есть это вполне реально: заказать гены, синтезировать с их помощью белки, собрать вирус.
— То есть это может сделать кто угодно?
— Нет, «распечатать» себе целый вирус любой желающий не сможет, компании, оказывающие услуги по синтезу ДНК, отслеживают такие запросы и контролируют, имеет ли клиент право на такое, не говоря о том, что это очень дорогое удовольствие.
— А насколько коммерческим клиникам сейчас реально купить названные тесты? ПЦР на ВИЧ, на гепатит С ведь делают почти во всех. То есть на их базе может проводиться тестирование и на COVID-19?
— «Инвитро» уже заявила, что готова это делать. CMD, по сути, тоже занимается ПЦР-диагностикой на коммерческих началах. Дело за регуляторами.
Амплификатор, аппарат на котором делается тест ПЦР. В верхней части аппарата помещаются пробирки с реагентами и исследуюемый материал
— Говорят, что в одном небольшом итальянском городе было протестировано 100 % населения, насколько такая тактика верна?
— У каждого теста есть погрешность. При низкой заболеваемости ложноположительных результатов может быть намного больше, чем выявленных реальных пациентов, даже если тест вполне хороший.
— То есть при высокой погрешности тестов на ложноположительные результаты будет приходиться больше? Тысячу человек протестировали, получили одного реально заболевшего и десять ложноположительных, у которых тест сработал на «плюс», но на самом деле вируса в их организме нет?
— Да. И это еще одна причина, помимо дефицита тестов, по которой специалисты призывают не бежать тестироваться здоровых, не контактировавших с больными и не бывавших в опасных регионах, — «на всякий случай», «просто потому что волнуюсь» и так далее.
— А что с западными тестами? Каково их качество? Почему нельзя было просто закупить и использовать их? Зачем нам было разрабатывать свои?
— И западные, и восточные (то есть китайские и корейские) тесты очень разные, их много, и, насколько я могу судить, наши тест-системы, хотя бы от тех же ЦСП и «ДНК-технологии», на их фоне смотрятся вполне достойно. Но подробнее это надо узнавать опять-таки у специалистов, которые держали в руках и те, и другие и могут сравнить. А я не держала.
Почему бы нам не закупить зарубежные тест-системы? Что ж, если в какой-нибудь стране сейчас есть лишние тесты на SARS-CoV-2 и цена невысокая, то, наверное, можно и закупить. Я не изучала этот вопрос специально, но мне не попадалось информации о том, что какое-то государство имеет излишек этих тестов, чаще речь идет об их нехватке.
ПЦР-тест
Полимеразная цепная реакция – что это такое, какие заболевания выявляет, в чем преимущества и недостатки анализа и что значат его результаты – в материале РИА Новости.
Анализ ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. В его основе лежит многократное увеличение малых концентраций фрагментов РНК и ДНК. Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом.
Он хотел добиться того, чтобы можно было создать множество копий ДНК за счет фермента ДНК-полимеразы, который участвует в ее репликации. За это Муллис получил Нобелевскую премию по химии. Известно, что еще в начале 1970-х годов похожий метод был представлен другим ученым, однако задумку так и не смогли реализовать.
Позже анализ был значительно усовершенствован и широко используется в биологической, биохимической и медицинской практике.
Как работает ПЦР
Для проведения анализа необходимо сложное, современное оборудование.
«Применяется специальный прибор, он называется амплификатор, в который помещается частица вируса или еще что-нибудь, содержащее РНК или ДНК, – рассказал РИА Новости кандидат медицинских наук, клинический фармаколог Андрей Кондрахин. – Дело в том, что РНК и ДНК достаточно маленькие, чтобы их определить, и понять есть ли в теле человека вредоносные микроорганизмы, поэтому делают ПЦР-тест.
В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их «видеть».
Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить, присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Для определения COVID-19 есть отдельный праймер. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК.
Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание».
Применение ПЦР
ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими.
«Метод применяется не только для вирусов, но и частичек ДНК, а также бактерий, – пояснил специалист. – Например, мы можем определить, к какому виду бактерия относится, например, к грамотрицательным или грамположительным».
Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности.
Проведение ПЦР
Для анализа требуется ДНК- или РНК-матрицы, участки которых нужно скопировать, два праймера с необходимыми ферментами, термостабильная ДНК-полимераза, а также некоторые другие компоненты. Метод ПЦР выявляет любую ДНК или РНК живого или мертвого возбудителя. Для их определения используют особые праймеры, в которых содержатся вырожденные позиции РНК или ДНК.
Подготовка материала
Этот этап чрезвычайно важен для проведения анализа ПЦР, потому что большинство ошибок, до 70% случаев, совершается именно во время пробоподготовки, что влияет на конечный результат анализа.
Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его.
Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом.
Какие биологические материалы исследуются
В исследовании обычно используются различные биоматериалы:
– Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин.
– Мокрота. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких.
– Биологические жидкости – околоплодная, спинномозговая, суставная и т.д.
– Соскобы со слизистых оболочек, например, носа или ротоглотки. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса.
– Кровь, сыворотка, плазма. Используются для определения вирусов ЦМВ (цитомегаловируса), ВИЧ, гепатитов B, C, D, G, герпеса, а также исследований человеческих генов.
– Биоптаты. Их забирают методом биопсии.
Преимущества и недостатки метода
ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется.
«Преимуществом метода является то, что можно определить возбудителя в малом количестве, просто в мизерном, – объяснил клинический фармаколог. – Благодаря этому можно быстрее поставить диагноз, потому что мы знаем, какой именно микроорганизм начинает развиваться.
В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество.
Мало, много, либо его вообще нет в организме».
По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала:
«Самый первый недостаток метода – необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать.
Второе – чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры – кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый – по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера.
Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования».
Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи.
Разновидности ПЦР
ПЦР-тест бывает нескольких видов:
– ПЦР с обратной транскрипцией. Его применяют для амплификации РНК.
- – Инвертированная ПЦР используется, если для анализа есть маленький участок последовательности ДНК или РНК.
- – Вложенная ПЦР нужна для уменьшения побочных реакций, для этого в амплификатор помещают два праймера.
- – Количественная ПЦР применяется для наблюдения за изменением цепной реакции.
- – Ступенчатая ПЦР позволяет снизить связывание праймеров.
- Кроме этого, есть асимметричная ПЦР и групп-специфическая ПЦР.
«Существует методика проведения ПЦР в реальном времени, – рассказал Андрей Кондрахин. – Это самый быстрый анализ, как говорится, здесь и сейчас. Его делают при помощи прибора, в котором есть картридж, определяющий только одну инфекцию, например, коронавирус. Кроме него аппарат ничего не видит, как и при обычном ПЦР, однако в таком случае результат можно получить намного быстрее».
Какие инфекции позволяет выявить
- Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить у человека инфекционные заболевания, например:
- – гепатит;
- – уреаплазмоз половых органов;
- – кандидоз (молочница);
- – хламидиоз;
- – папилломавирусная инфекция;
- – герпес;
- – наличие раковых клеток;
- – микоплазмоз;
- – бактериальный вагиноз;
- – инфекционный мононуклеоз;
- – трихомониаз;
- – СПИД (ВИЧ).
- Также тестирование помогает выявить наследственную предрасположенность человека к некоторым заболеваниям и оценить гормональный фон.
ПЦР-тест на COVID-19
Для ПЦР-теста на коронавирус у человека берется мазок из носа и ротоглотки. Во время пандемии его рекомендуют сдать всем, кто болеет ОРВИ, гриппом, пневмонией и т.д.
Берут материал для анализа амбулаторно, также специалист может выехать на дом. Согласно требованиям, пациента выписывают после двух отрицательных тестов на наличие инфекции.
ПЦР-тесты могут давать ложноположительный или ложноотрицательный результат, в таком случае необходимо повторное исследование.
Как подготовиться к сдаче анализа
«Специальной подготовки вообще не требуется, разве что не принимать пищу за три часа (минимум) перед забором материала, если будут брать мазок из ротовой полости. Частички еды могут извратить результат. Достаточно прополоскать рот с водой и идти на анализ», – пояснил специалист.
Перед мазком также не рекомендуется пить кофе, чай, иные напитки, чистить зубы, полоскать рот освежающими смесями, жевать жевательную резинку, курить. Нос нельзя промывать, закапывать туда капли или мазать лекарствами.
Если берут кровь, то ее необходимо сдавать натощак, чтобы результат был максимально точным. Мочу следует собирать в утреннее время суток натощак или через 2-3 часа после приема пищи. Желательно сделать это сразу после сна.
Расшифровка анализа ПЦР
После проведения теста результаты оцениваются и аппаратурой, и специалистами-медиками.
«В конце теста машина сообщает, что она нашла в мазке, а врач-лаборант описывает результат, – объяснил эксперт. – Если в программу машины заложена информация о том, при каких количествах считается тест положительным, значит, это будет делать автомат. В анализе будет либо да, либо нет.
Самому человеку ничего расшифровывать не нужно, единственное, что специалист может посмотреть за машиной – это количество кусочков РНК, потому что бывают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, если в аппарате произошел сбой. Все равно контроль со стороны врача присутствует».
Насколько точна ПЦР-диагностика инфекций
«ПЦР абсолютно точна, практически 99,9%, потому что аппарат построит абсолютно такую же РНК, как слепок с ключа, один в один. Там ничего нового сделать нельзя. Набор частичек увеличивается до того количества, которое может распознать машина. Сделать это можно, даже если частиц очень мало», – отметил Андрей Кондрахин.
При этом из-за того, что зачастую встречаются ошибки при взятии биологического материала и существует вероятность попадания инородных частичек, могут возникать ложноположительные или ложноотрицательные результаты тестирования на коронавирус.
Портал «Вечная молодость» http://vechnayamolodost.ru
Анализ ПЦР
ПЦР (метод полимеразной цепной реакции) — экспериментальный метод, использующийся при лабораторной диагностике многих инфекционных заболеваний и позволяющий обнаружить большинство микроорганизмов.
С помощью этого анализа можно выявить и идентифицировать в биоматериале следы различных микроорганизмов, даже если они присутствуют в очень малых количествах.
Метод полимеразной цепной реакции был открыт и впервые использован в 1983 г. В 1993 году создатель анализа ПЦР был награжден Нобелевской премией за бесценный вклад в развитие медицины.
Лечитесь выгодно и эффективно!
Акция для женщин: Комплексная диагностика ПОЛОВЫХ ИНФЕКЦИЙ Полная стоимость комплексного обследования по прейскуранту — 5050 рублей. Цена со скидкой — 4450 рублей
Акция для мужчин: Комплексная диагностика ПОЛОВЫХ ИНФЕКЦИЙ Полная стоимость комплексного обследования по прейскуранту — 5050 рублей. Цена со скидкой — 4300 рублей
У каждого живого организма имеется свой уникальный набор хромосом. Ни у одного существа он не повторяется, но все хромосомы образованы ДНК — дезоксирибонуклеиновой кислотой. ДНК состоит из множества мельчайших молекул, называемых нуклеотидами.
Последовательности цепочек этих молекул образуют гены. Гены же отвечают за кодировку синтеза огромного количества белков, таких, как глобулин, коллаген и т. д.
Последовательность нуклеотидов у каждого организма уникальна, за исключением схожих участков ДНК, отвечающих за относительное однообразие в пределах вида организма. Методом ПЦР находят фрагменты нуклеиновой кислоты и определяют, какому виду микроорганизма они принадлежат.
Но анализ ДНК небольшого количества микробов будет малоинформативен. Чтобы иметь возможность выявить и исследовать определенные видовые закономерности, необходимо увеличить количество нуклеотидов во много сотен раз. Для этого также используют методику ПЦР.
Чтобы получить достаточное количество материала для проведения исследования, к ДНК микроорганизма добавляют определенные нуклеотиды, а также ДНК-полимеразу. Этот фермент обеспечивает многократное копирование интересующего исследователей участка.
Катализатором (веществом, запускающим реакцию) процесса служат нити РНК, крепящиеся к гену, который и необходимо изучить. За несколько часов анализа всего из одного нуклеотида можно получить достаточное количество материала для исследований.
Этапы анализа
- Сбор и доставка в лабораторию биоматериала человека (слюны, крови, мочи или любой другой биологической жидкости).
- Очищение нужной хромосомы и разделение двух образующих ее нитей ДНК.
- Выделение требующегося нуклеотида и дальнейшее его удвоение.
Далее количество копируемого материала стремительно увеличивается в геометрической прогрессии.
- Разделение участков ДНК реакцией электрофореза, обработка растворами, вызывающими свечение или изменение цвета ДНК. Анализ устанавливает вид искомого микроорганизма.
Длительность анализа ПЦР обычно составляет от трех до пяти часов, но результаты приходят в клинику не ранее, чем через сутки.
Преимущества метода ПЦР
На данный момент метод ПЦР — один из лучших способов определения возбудителей инфекции по нескольким причинам:
- Специфичность — определение конкретного вида возбудителя, что облегчает подбор лечения.
- Высокая точность за счет определения ДНК возбудителя, а не выявления антител, вырабатываемых организмом.
- Минимум биоматериала. Для диагностики хватает количества материала в сотни раз меньшего, чем требуется при других анализах.
- Возможность проанализировать практически любой биоматериал. Обнаруживает следы возбудителя в биологических жидкостях и в других клетках организма.
- Возможность диагностировать бессимптомные инфекции.
- Высокая скорость получения результатов анализа.
- Автоматизация процесса диагностики.
- Исключение контакта посторонних с биоматериалом, что, в свою очередь, исключает возможность заражения.
Недостатки метода ПЦР
Проблемы в основном связаны с технической сложностью процесса:
- Необходим правильный подбор РНК для катализации процесса и приготовление подходящей смеси нуклеотидов.
- Из-за крайне высокой чувствительности при инфицировании сразу несколькими микроорганизмами метод может дать неверный результат.
- Необходимость сравнения биообразцов с препаратами, в которых заведомо находится ДНК искомого микроорганизма.
- Для повышения точности диагностики необходимо как можно тщательнее очистить нити ДНК от любых посторонних примесей, что повышает сложность анализа.
Ложноположительные и ложноотрицательные результаты
Ошибки анализа обусловлены двумя факторами:
- Для ложноотрицательных результатов такой фактор — нарушение техники проведения анализа.
- Для ложноположительных — случайное совпадение нуклеотидов или применяемых при исследовании реактивов с ДНК микроорганизма.
Следует учитывать, что даже при идентификации микроорганизма не всегда можно с уверенностью сказать, послужил ли он причиной болезни. К сожалению, генетическая основа множества неинфекционных заболеваний все еще неизвестна, что делает невозможной диагностику многих патологий.
Показания для назначения исследования ПЦР
Назначение ПЦР-диагностики оправдано в случае инфекционных заболеваний и необходимости определить природу возбудителя.
Также метод ПЦР применяется при:
- необходимости точной идентификации возбудителя;
- диагностике некоторых генетических заболеваний;
- анализе образцов биопсии, исследование которых стандартными методами невозможно;
- необходимости идентификации личности путем сравнения части ДНК человека с биоматериалом заведомо известного происхождения;
- диагностике злокачественных новообразований и лейкоза;
- проведении генетических экспериментов с животными с заложенными еще до их рождения генетическими заболеваниями.
Также есть много возможных способов применения анализа ПЦР при проведении исследований в области медицины и биологии, от испытания степени эффективности лекарств уже на молекулярном уровне и до создания полностью автономных живых организмов с определенными свойствами.
На данный момент ПЦР-анализ применяется для диагностики достаточно обширного круга заболеваний, например:
- Самых страшных заболеваний — ВИЧ-инфекции и гепатитов А, В, С, Е;
- заболеваний, передающихся половым путем (ИППП);
- туберкулеза;
- внутриклеточных инфекций (вирусы, бактерии) и многих других болезней.
При подозрении на наличие ЗППП направление выдает гинеколог, уролог или андролог. При туберкулезе исследование назначает фтизиатр, а при подозрении на ВИЧ или вирусные гепатиты — инфекционист. Также для более точной постановки диагноза ПЦР используют онкологи, онкогематологи, генетики.
Подготовка к сдаче анализа
- За 72 часа до сдачи биоматериала на ПЦР нужно полностью отказаться от употребления алкоголя. Также по назначению врачей могут быть отменены некоторые антибиотики.
- За 48 часов необходимо исключить нагрузки. В день сдачи биоматериала запрещается принимать пищу, а также курить.
- При необходимости сдачи материала на анализ из ротовой полости или носоглотки запрещается в день исследования чистить зубы.
При диагностике ЗППП:
- Не вступать в половой контакт 48 часов до анализа.
- Подмываться разрешено без любых гигиенических средств, последнее спринцевание не позже чем за 12 часов.
- За 2 часа до взятия биоматериала не мочиться.
- Запрещается сдавать анализ во время менструаций и на протяжении 4 дней после колоноскопии.
Точность и информативность диагностики будет зависеть от соблюдения этих несложных правил.
После получения результата исследования обязательно нужно обратиться к врачу, так как самостоятельная расшифровка медицинского заключения не даст достоверной информации о заболевании и методах его лечения.
Расшифровка результатов
Результат ПЦР всегда однозначен: он либо положительный, либо отрицательный. Отрицательный означает, что человек здоров, так как следов чужеродной ДНК не выявлено. Положительный же подразумевает наличие у человека фрагментов ДНК чужеродных микроорганизмов, что означает заражение. В таком случае требуется лечение.
Так как ПЦР является высокоточным методом диагностики, даже если пациент не чувствует недомогания и не замечает у себя никаких симптомов болезни, это не означает что он здоров — скорее это значит, что анализ просто выявил возбудителя на ранней стадии, пока тот еще не успел навредить организму.
Начало терапии в таком случае нельзя откладывать, ведь чем быстрее начнется лечение, тем легче удастся побороть болезнь.
ПЦР-диагностика обнаруживает микроорганизмы даже по единственной молекуле ДНК в пробе. Именно поэтому анализ ПЦР — наиболее эффективный диагностический инструмент, позволяющий выявить болезнь практически на любой ее стадии и контролировать ход ее лечения.
ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки.
Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» — ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам.
Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК.
Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК. Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий.
После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) — уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя.
И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз. И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата. Амплификация (увеличение числа копий ДНК) Важнейший этап исследования.
Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация. Денатурация Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы.
Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C. Отжиг Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот.
Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот. Такой температурный цикл проводится 30 и более раз.
В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).
Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
- Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
- Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
- ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.
Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки. Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др. Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.).
А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию. Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ.
Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа. В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов. Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка.
Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого. Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
пцр диагностика на Инфекции:
ПЦР на ВИЧ ПЦР на Вирусные гепатиты
Оставить комментарий